IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactoside) is in analoog fan β-galactosidase substraat, dat tige yndusearber is. Under de ynduksje fan IPTG kin de ynduktor in kompleks foarmje mei it repressorprotein, sadat de konformaasje fan it repressorprotein feroaret, sadat it net kombinearre wurde kin mei it doelgen, en it doelgen effisjint útdrukt wurdt. Dus hoe moat de konsintraasje fan IPTG bepaald wurde tidens it eksperimint? Is hoe grutter hoe better?
Earst, litte wy it prinsipe fan IPTG-ynduksje begripe: E. coli's laktose-operon (elemint) befettet trije strukturele genen, Z, Y, en A, dy't kodearje foar β-galaktosidase, permease, en acetyltransferase, respektivelik. lacZ hydrolysearret laktose yn glukoaze en galaktose, of yn allolaktose; lacY lit laktose yn 'e omjouwing troch it selmembraan gean en de sel yngean; lacA draacht de acetylgroep oer fan acetyl-CoA nei β-galaktoside, wat it fuortheljen fan it toksyske effekt omfettet. Derneist is d'r in operasjesekwinsje O, in startsekwinsje P en in regulatorysk gen I. De I-genkoade is in repressorprotein dat kin bine oan 'e posysje O fan' e operatorsekwinsje, sadat de operon (meta) ûnderdrukt en útskeakele wurdt. D'r is ek in bindingsplak foar katabolysk genaktivatorprotein - CAP-bindingsplak stroomop fan 'e inisjearjende sekwinsje P. De P-sekwinsje, O-sekwinsje en CAP-bindingsplak foarmje tegearre de regulatoryske regio fan 'e lac-operon. De kodearjende genen fan 'e trije enzymen wurde regele troch deselde regeljouwingsregio om de koördinearre ekspresje fan genprodukten te berikken.
By it ûntbrekken fan laktose is it lac-operon (meta) yn in steat fan represje. Op dit stuit bindt de lac-repressor útdrukt troch de I-sekwinsje ûnder kontrôle fan 'e PI-promotorsekwinsje oan 'e O-sekwinsje, wat foarkomt dat RNA-polymerase oan 'e P-sekwinsje bindt en transkripsje-inisjaasje remt; as laktose oanwêzich is, kin it lac-operon (meta) ynducearre wurde. Yn dit operon (meta)-systeem is de echte ynducer net laktose sels. Laktose komt de sel yn en wurdt katalysearre troch β-galaktosidase om omset te wurden yn allolaktose. De lêste, as in ynducermolekule, bindt oan it repressorprotein en feroaret de proteïnekonformaasje, wat liedt ta de dissosiaasje fan it repressorprotein fan 'e O-sekwinsje en transkripsje. Isopropylthiogalactoside (IPTG) hat itselde effekt as allolaktose. It is in tige krêftige ynducer, dy't net metabolisearre wurdt troch baktearjes en tige stabyl is, dêrom wurdt it in soad brûkt yn laboratoaria.
Hoe kinne jo de optimale konsintraasje fan IPTG bepale? Nim E. coli as foarbyld.
De genetysk manipulearre E. coli BL21-stam mei de positive rekombinante pGEX (CGRP/msCT) waard yninting yn floeiber LB-medium mei 50μg·mL-1 Amp, en oernachtich kultivearre by 37°C. De boppesteande kultuer waard yninting yn 10 flessen fan 50mL farsk floeiber LB-medium mei 50μg·mL-1 Amp yn in ferhâlding fan 1:100 foar útwreidingskultuer, en doe't de OD600-wearde 0.6~0.8 wie, waard IPTG tafoege oan de definitive konsintraasje. It is 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0mmol·L-1. Nei ynduksje by deselde temperatuer en deselde tiid waard 1 mL fan 'e baktearjele oplossing derút nommen, en de baktearjesellen waarden sammele troch sintrifugaasje en ûnderwurpen oan SDS-PAGE om de ynfloed fan ferskate IPTG-konsintraasjes op proteïne-ekspresje te analysearjen, en dan de IPTG-konsintraasje mei de grutste proteïne-ekspresje te selektearjen.
Nei eksperiminten sil bliken dwaan dat de konsintraasje fan IPTG net sa grut mooglik is. Dit komt om't IPTG in bepaalde toksisiteit hat foar baktearjes. It oerskriuwen fan de konsintraasje sil ek de sel deadzje; en yn 't algemien hoopje wy dat hoe mear oplosbere proteïne der yn 'e sel útdrukt wurdt, hoe better, mar yn in protte gefallen as de konsintraasje fan IPTG te heech is, sil in grutte hoemannichte ynklúzje foarme wurde. It lichem, mar de hoemannichte oplosbere proteïne nimt ôf. Dêrom is de meast geskikte IPTG-konsintraasje faak net hoe grutter hoe better, mar hoe leger de konsintraasje.
It doel fan ynduksje en kultivaasje fan genetysk manipulearre stammen is om de opbringst fan it doelprotein te ferheegjen en de kosten te ferminderjen. De ekspresje fan it doelgen wurdt net allinich beynfloede troch de eigen faktoaren fan 'e stam en it ekspresjeplasmide, mar ek troch oare eksterne omstannichheden, lykas de konsintraasje fan 'e ynduktor, de ynduksjetemperatuer en de ynduksjetiid. Dêrom is it yn 't algemien, foardat in ûnbekend protein útdrukt en suvere wurdt, it bêste om de ynduksjetiid, temperatuer en IPTG-konsintraasje te bestudearjen om de passende omstannichheden te selektearjen en de bêste eksperimintele resultaten te krijen.
Pleatsingstiid: 31 desimber 2021