IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactoside) is in analoog fan β-galactosidase substraat, dat is tige inducible.Under de ynduksje fan IPTG kin de inducer in kompleks foarmje mei it repressorprotein, sadat de konformaasje fan 'e repressorprotein feroaret, sadat it net kombinearre wurde kin mei it doelgen, en it doelgen is effisjint útdrukt.Dus hoe moat de konsintraasje fan IPTG wurde bepaald tidens it eksperimint?Is hoe grutter hoe better?
Litte wy earst it prinsipe fan IPTG-ynduksje begripe: E. coli's lactose-operon (elemint) befettet trije strukturele genen, Z,Y, en A, dy't respektivelik kodearje foar β-galactosidase, permease en acetyltransferase.lacZ hydrolyseart laktose yn glukoaze en galactose, of yn allo-laktose;lacY lit laktose yn 'e omjouwing troch it selmembraan passe en komt yn' e sel;lacA ferpleatst de acetylgroep fan acetyl-CoA nei β-galactoside, wat omfettet it fuortheljen fan Toxic effekt.Dêrnjonken is der in operearjende folchoarder O, in startsekwinsje P en in regulearjend gen I. De I-genkoade is in repressorprotein dat kin bine oan de posysje O fan 'e operatorsekwinsje, sadat it operon (meta) ûnderdrukt wurdt en útsetten.Der is ek in binende site foar katabolic gene activator protein-CAP binding site streamop fan de inisjearjende folchoarder P. De P folchoarder, O folchoarder en CAP binende site tegearre foarmje de regeljouwing regio fan de lac operon.De kodearjende genen fan 'e trije enzymen wurde regele troch deselde regeljende regio om de koördinearre ekspresje fan genprodukten te berikken.
By it ûntbrekken fan laktose is it lac operon (meta) yn in steat fan ûnderdrukking.Op dit stuit is de lac-repressor útdrukt troch de I-sekwinsje ûnder de kontrôle fan 'e PI-promotor-sekwinsje bynt oan' e O-sekwinsje, dy't foarkomt dat RNA-polymerase bindet oan 'e P-sekwinsje en inisjatyf fan transkripsje ynhibearret;as lactose oanwêzich is, kin it lac operon (meta) opwekke wurde Yn dit operon (meta) systeem is de echte inducer net lactose sels.Laktose komt yn 'e sel en wurdt katalysearre troch β-galactosidase om te konvertearjen nei allolactose.Dat lêste, as in inducer-molekule, bindet oan it repressorprotein en feroaret de proteinkonformaasje, wat liedt ta de dissosjaasje fan it repressorprotein út 'e O-sekwinsje en transkripsje.Isopropylthiogalactoside (IPTG) hat itselde effekt as allolactose.It is in heul krêftige ynduktor, dy't net troch baktearjes metabolisearre wurdt en tige stabyl is, dus it wurdt in protte brûkt yn laboratoaren.
Hoe te bepalen de optimale konsintraasje fan IPTG?Nim E. coli as foarbyld.
De E. coli BL21 genetysk manipulearre stam dy't de positive rekombinante pGEX (CGRP / msCT) befette, waard ynokulearre yn LB floeiber medium mei 50μg · mL-1 Amp, en oernachtich op 37 ° C kultivearre.De boppesteande kultuer waard yn 10 fleskes fan 50mL frisse LB floeibere medium mei 50μg · mL-1 Amp yn in ferhâlding fan 1:100 foar útwreidingskultuer, en doe't de OD600-wearde 0.6 ~ 0.8 wie, waard IPTG tafoege oan 'e definitive konsintraasje.It is 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0 mmol·L-1.Nei induction by deselde temperatuer en deselde tiid, 1 mL fan de baktearjele oplossing waard nommen út it, en de baktearjele sellen waarden sammele troch centrifugation en ûnderwurpen wurde oan SDS-PAGE te analysearjen de ynfloed fan ferskillende IPTG konsintraasjes op protein ekspresje, en dan selektearje de IPTG-konsintraasje mei de grutste proteïne-ekspresje.
Nei eksperiminten sil it fûn wurde dat de konsintraasje fan IPTG net sa grut mooglik is.Dit is om't IPTG in bepaalde toxiciteit hat foar baktearjes.It oersjen fan de konsintraasje sil ek de sel deadzje;en oer it generaal hoopje wy dat de mear oplosber aaiwyt útdrukt yn 'e sel, it better, mar yn in protte gefallen doe't de konsintraasje fan IPTG is te heech, in grut bedrach fan inclusion wurdt foarme.Lichaam, mar it bedrach fan oplosber proteïne fermindere.Dêrom is de meast geskikte IPTG-konsintraasje faaks net hoe grutter hoe better, mar hoe leger de konsintraasje.
It doel fan ynduksje en kultivaasje fan genetysk manipulearre stammen is om de opbringst fan it doelprotein te ferheegjen en kosten te ferminderjen.De ekspresje fan it doelgen wurdt net allinnich beynfloede troch de eigen faktoaren fan 'e stam en it ekspresjeplasmide, mar ek troch oare eksterne omstannichheden, lykas de konsintraasje fan 'e inducer, de ynduksjetemperatuer en de ynduksjetiid.Dêrom, yn 't algemien, foardat in ûnbekend proteïne wurdt útdrukt en suvere, is it it bêste om de yndeksjetiid, temperatuer en IPTG-konsintraasje te studearjen om de passende betingsten te selektearjen en de bêste eksperimintele resultaten te krijen.
Post tiid: Dec-31-2021